续——最近的一次作业（blogcn: 2006-10-18 22:46）

Gastrointestinal models
The Nordic network experiments with the TNO gastrointestinal tract model
focused on survival studies after gastric and ileal delivery. The SHIME-reactor
was chosen to illustrate the population dynamics in the small and large intestine.
Parameters such as pH, redox state, NH4, SCFA, gas composition, enzyme
activities and major bacterial groups were determined. As indicated already in
the discussion of adhesion, changes occurred in samples taken from different
parts of the TNO model system. Some of the non-viable bacteria recovered from
the TNO model also showed some immunological activity. Probiotic treatment
was shown to increase temporarily the numbers of lactic acid bacteria in
different parts of the SHIME ecosystem. Enterobacteriaceae decreased markedly
during treatment. The results indicated that further studies are necessary in order
to evaluate the repeatability of the SHIME system in the assessment of fatty acid
and enzymatic profile changes (Table 12.5).33

Anti-mutagenicity properties
Lactic acid bacteria or cultured dairy products have been reported to reduce the
mutagenicity of known chemical mutagens in in vitro tests.34 In in vivo trials
probiotic strains have occasionally been associated with the reduction of faecal
enzymatic activities involved in mutagen or carcinogen activation.35 Results
have been somewhat contradictory in trials studying the effects of orally
ingested probiotic strains on actual faecal mutagenicity. Lidbeck and co-workers
detected a decrease in faecal and urinary mutagenicity as a result of
Lactobacillus acidophilus NCFB 1748 consumption.36 No such effect was seen
in similar tests with another probiotic.37

12.2.2 The Probdemo strains
One of the first tasks of the Probdemo project was to establish selection criteria
for probiotic strains, and then apply these specific criteria for selecting the
project strains. The preliminary selection criteria included stability in in vitro
models simulating conditions in the upper gastrointestinal tract, where probiotic
bacteria are first exposed to an acidic and protease-rich environment in the
stomach before encountering bile acids in the small intestine. Other selection
criteria employed included the ability to adhere to intestinal mucosae, the ability
to inhibit intestinal pathogens and safety to the consumers.5, 11, 12 Application of
these selection criteria resulted in the selection of the following probiotic strains:
L. rhamnosus GG, Lactobacillus johnsonii LJ-1, Lactobacillus salivarius UCC
118, Lactobacillus crispatus M247, L. paracasei F19, and B. lactis Bb-12.
Bifidobacterium longum UCC 35624 was later included in the study due to its
promising positive influence on inflammatory bowel diseases.

Further characterisation of these strains, both at the phenotypic and genotypic
level, continued throughout the project. This led to the discovery of new
mechanisms for colonisation in the human intestinal tract such as expression of
co-aggregation proteins.38, 39 In safety studies it was demonstrated that the genes
encoding vancomycin resistance in L. rhamnosus GG were distinct from the
transferable genes in Enterococcus, indicating that they do not pose a safety
concern in this strain.40 The probiotic properties of the strains are now known to
be chromosomally encoded rather than being coded on potentially unstable
plasmids. Further research on the probiotic mechanisms of the project strains
(including molecular studies to determine how and where they adhere to
intestinal mucosae, inhibit pathogens and induce immunomodulation in the host)
has been performed, yielding further insights into how probiotic bacteria can be
selected and can benefit human health.

12.3 Pilot testing in clinical human trials
Probiotic strains should be safe and clinically tested prior to commercial human
use. Although this is an important aspect, no firm guidelines exist for safety
criteria. Examples of clinical and safety criteria for probiotic foods are listed in
Tables 12.6 and 12.7.16, 41
Guidelines for probiotic clinical trials (Probdemo approach) stem from the
trial design using volunteers (healthy or diseased in case of demonstration). In a
trial design volunteers should be randomly selected from a panel of a specific
population group targeted for the trial. A number of exclusion criteria were
employed when choosing the original healthy volunteer panel. These exclusion
criteria were the following:
• antibiotic treatment during the last month
• strong chronic intestinal disorders
• chronic inflammatory diseases
• chronic viral illness
• current drug therapy

上面的是原文，下面的是我的翻译。从来没做过这么多的翻译，7000+的字，贴在这里，全当日后的纪念。文中的表格和图都没有贴上来，经常出现在句末的奇怪的数字是文中的注解。

第十二章
益生菌类功能食品
T.Mattila-Sandholm and M.Saarela, VTT Biotechnology, Espoo

12．1 引言：益生菌类食品对于健康的益处
在欧洲，有益健康的食品这一领域被视为优先考虑的研究领域，这是基于对通过食物促进健康有着巨大潜力的认识。此外，饮食是公共健康策略的一个主要焦点，它针 对于终生维持最佳的健康状况，阻止诸如胃肠道疾病、心血管疾病、癌症和骨质疏松症等慢性疾病的早期发作，以及促进更加健康的老龄化。虽然人们对食物和健康 之间高度复杂的关系仍然知之甚少，但是近期在不同学科中的研究进展给人们提供了新的有希望的方法去增加对它的了解。对健康食品的越来越大的需求正在刺激国 际间的食品工业的革新以及新产品的发展，而的确，通过健康食品的供应和促销，食品工业在促进改良的饮食行为中占有中心地位。

益生菌是活的微生物食物的补充，它通过维持或改善肠内微生物的平衡而有益于消费者的健康。1 由于它们可感知的健康益处，在过去的二十年里，益生菌已经越来越多地含于酸奶和发酵牛奶中。通常情况下，它们是像嗜酸乳酸杆菌 （Lactobacillus acidophilus）这样的乳酸杆菌，以及像双叉乳杆菌这样的双歧杆菌（见表12.1）。2 功能食品的一个主要新生物就是包含有益生菌和可以增强肠道中有益健康的微生物菌落的益生助生质的食品。越来越多的科学证据支持维持健康的内脏微生物菌落可 能预防包括胃肠道感染、肠炎，甚至癌症在内的胃肠道疾病这一观念。益生菌培养的运用可以刺激一些微生物的优先生长，驱逐有潜在危害的细菌，并且加强人体的 自然防御机制。

益生菌要有益于人类健康，必须满足以下几个标准：它必须拥有良好的工艺学特性，这样才能够被 加工、混合进入食品产品中，并且不丧失生活力和功能性，不产生令人不悦的气味或质地；它必须能够在通过上胃肠道以及到达其作用地点的时候都能存活；它必须 能够在内脏环境中发挥功能。为了研究胃肠道中的益生菌株，我们必须建立从所摄入的构成胃肠生态系统的潜在的成千上万种菌株中鉴别出益生菌株的分子技术，还 要建立能够证实益生菌株对肠道内其他小型微生物群落的作用以及对宿主的重要作用的技术。这不仅要有积极的健康方面的利益，还要证明益生菌株没有任何的毒害 作用。有了这些知识的辅助，益生菌才能进入临床的初步研究中，以评估其对消费者临床健康益处的大小（表12.2）。

12．1．1 益生菌食品营养功能性的证明（FAIR CT96-1028）
欧洲拥有传统上益生菌市场的领先地位。但是，消费者对于益生菌有着相当多的混淆和怀疑，而与其有关的消费者组织和某些科学团体就把这与益菌性的产品联系起 来。这极大地妨碍了含有益生菌的功能食品的开发，也削弱了欧洲生产商面对竞争时的市场地位。要消除这些障碍，加快对益生菌食品科技的适应，以及增加新的益 生菌食品的吸引力，关键在于通过介绍益生菌、益生菌食品的健康和营养益处来证明目前市场要求这一基础，特别要将重点放在肠道的整体性和免疫调节性，发掘选 择新的益生菌和益生菌食品的有效方法，并且向由企业、当局和消费者组成的广大受众普及已有知识等方面。Probdmo工程的启动就是为了向欧洲的消费者证 明益生菌产品的价值，它的目标分为四个相互作用的任务
（表12.3）：
1． 建立一个普遍适用的为功能食品选择益生菌株的科学的基础的方法。代表乳酸杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）的六种益生菌株被选作证明之用。
2． 证明益菌性食品在包括儿童和成人在内的人类初步试验中的有益价值。初步的测试表明益生菌株对健康的儿童和成人没有任何毒害作用。此外，益生菌株在治疗婴儿的食物过敏以及幼童的由轮状病毒引起的腹泻方面显示出效果，它也被证明对成人的肠炎有疗效。
3． 证明并满足功能的和工艺的要求。这对于将益生菌作为功能食品进行工业生产是必需的。通过对益生菌株体外特性的研究并将结果反映在临床表现上，研究人员已经 实现了上述的要求。现在主要的焦点集中在通过人类活组织检查证明体外与体内试验间的联系，证明益生菌株产品的工艺标准，以及益生菌株试生产等方面上。
4． 向包括企业主、当局和消费者组织在内的广大受众普及有关益生菌的知识和试验结果。这一点已经通过年度的研讨会实现（关于益生菌安全的第一届研讨会于 1996年召开，关于益生菌研究工具的第二届研讨会于1997年召开，关于功能食品研究的第三届研讨会于1998年召开，关于功能食品的第四届研讨会于 2000年召开）。5-8

基于先前的EU项目在乳酸菌和益生菌方面的成果，工程的参与者和研究所在这个研究 领域内都有着丰富的经验，工业合作伙伴有着长期参与功能食品市场的惯例对益生菌产品来说也有着特殊的意义。芬兰的VTT生物科技（VTT Biotechnology）扮演着协调和普及相关活动和证明任务的角色，这些活动和任务是关于益生菌株特性、工艺特性和成人临床测试的；荷兰的瓦格宁根 大学（The University of Wageningen）在通过使用包括PCR、原位杂交、变性梯度凝胶电泳法和温度梯度凝胶电泳在内的分子方法来证明益生菌株在人类临床试验上的活性和生 存力方面扮演着关键的角色；意大利的皮亚琴察天主教大学（The Catholic University of Piacenza）扮演着展示将被证明的菌株的粘附和聚合特性的角色；爱尔兰的国立科克大学（The University of College Cork）在人类胃肠病学、成人临床检测和益生菌的免疫调节活性等方面有着造诣精深的专业技术；芬兰的图尔库大学（University of Turku）在儿童临床检测以及临床儿科和功能食品之间的联系方面有着长期的科学传统。Valio有限公司（芬兰）、Arla（瑞典）、Nestlé（瑞 士）和Christian Hansen实验室（丹麦）等工业合作伙伴有着益生菌产品工业生产的坚实基础、功能食品市场的丰富经验和此领域内进行的研究，它们在选择待证明的菌株、准 备待开发的产品以及验证它们的有益效果等方面是极为重要的。

12．2 选择益生菌株
表12.4和图12.1中所示的益生菌微生物的选择理论基础包括：
·安全
· 功能行为 【存活率，粘连，成菌落性，抗菌产品，免疫刺激，抗遗传毒性的活力，以及对诸如幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）、沙门氏菌（Salmonella）、李斯特菌属（Listeria）和梭状芽胞杆菌（Clostridium）等病原体的预防】
·工艺方面（在牛奶中的生长，感官特性，稳定性，噬菌体抗性，在处理中的成活力）

总的来说，用于探索性试验的菌株应该基于已有的体外试验的科学性的数据来进行选择。自然地，益生菌株的安全成为了最重要的问题，而且新的指导方针也已经制定 出来。9-13 成功的益生菌目前的安全标准和功能特性在近期的综述中已经有了详细的说明，14-16 它们包括以下的技术条件：
·用于人类的菌株最好来自于人类
·它们是从健康人的胃肠道中分离散出来的
·它们即使在免疫妥协的宿主体内也有不致病的历史
·它们没有与诸如传染性心内膜炎和胃肠道疾病有联系的历史

研究人员最近在讨论人类来源的重要性，但是大多数（如果不是全部的话）目前成功的菌株都是人类来源的。同样的，研究人员也在争论菌落生长的能力在人类胃肠道 中的重要性。然而，大多数目前所报道的菌株能够在人体中耐受，至少暂时可以在摄入后在人的排泄物中检测到。酸和胆汁的稳定性对于任何可能会在肠道中有显著 效果的菌株来说都是应该具有的基本特性。粘附和耐受的能力也是与潜在的免疫效力关系极为密切的，很有可能需要某些粘附以及（或者）结合于肠道细胞的机制。 如此一来，像Caco-2细胞系这样的体外模型系统的对照比较研究就很重要了。17，18 由于有粘附性的益生菌株可能在肠道内停留更长的时间，进而比非粘附性的菌株有着更多的机会发挥代谢效果，它一出现便受到人们的青睐，并且至少有一种商业益 生菌株已经被证明可以粘附在体内的粘膜上。19

由于对结肠菌群有影响，对于益生菌株来说，通过抗菌产物或者竞争性排斥表现 出对病原菌的对抗状态是很重要的。虽然大量的研究成果集中在细菌素的研究上，但是，益生菌在内脏中的细菌素功能和有效性模式是未知的。虽然益生菌株可能在 体外生产细菌素，但是细菌素在病原菌抑制方面的作用在体内只是有限的，因为传统的细菌素只对与像其他的乳酸杆菌（Lactobacillus）密切相关的 种类有抑制作用，或者对诸如芽胞杆菌（Bacillus）或梭状芽胞杆菌（Clostridium）的孢子生成菌（sporeformer）有抑制作用。 然而，小分子量的代谢产物（以及次级代谢产物）可能是很重要的，因为它们表现出对诸如沙门氏菌（Salmonella）、大肠杆菌 （Escherichia coli）、梭状芽胞杆菌（Clostridium）和缠绕杆菌（Helicobacter）等有害微生物的广谱抑制作用。20-22

12．2．1 针对功能性益生菌食品培育的发展
包括培育的奶产品在内的益生菌奶制品及其培育在北欧食品工业产品中具有悠久的历史和巨大的消费量，并且其益生菌特性也已经被研究了数十年。北欧项目 （Nordic programme，1994年至1997年末）是为了确认工业益生菌株的体外功能性，菌株由工程的参与者Arla（瑞典）、Christian Hansen（丹麦）、Norwegian Dairies（挪威）和Valio Ltd（芬兰）提供。所研究的菌株有：类干酪乳杆菌类干酪亚种（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）菌株E-94522和E-94510，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）菌株E-94509和E-94522，嗜酸性乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）E-94507，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）E-79098，乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis）E-90414，乳酸乳球菌乳脂亚种（L. lactis subsp. cremoris）E-94523，乳制品动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis lactis）E-94508和长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）E-94505。研究包括体外的细胞因子释放效果、粘附特性、抗诱变性以及在胃肠道模型（荷兰的TNO胃肠道模型和比利时Ghent的 SHIME的生态系统）中的行为。此外，研究人员也在评估其工艺和产品特性。

粘附特性的评估
先粘附 在人类肠细胞上，随后在人类胃肠道中生长为菌落被认为是益生菌发挥其功能的重要的先决条件，粘附检验菌株寄居于肠道并在肠环境中生长的潜力，也提供了促进 与内脏接触、调节局部和系统免疫效力的淋巴组织的粘膜表面相互作用。因而，只有具粘附能力的益生菌可以诱导免疫效力并稳定肠粘膜屏障。23 北欧项目工程的体外粘附检测结果对于不同的检测和菌种间的不同及变化有一个清晰的指征，很明显，除了Caco-2细胞系试验之外，其余的检测系统也需要具 有粘附潜力及不同粘附机制的特征。粘附系统也用于研究益生菌株的抗侵入潜力。不同的益生菌株在侵入抑制方面表现出相对不同的行为，而且需要有新的方法从与 临床表现相关的角度去评估这些特性。粘附试验表明不同益生菌株生长为菌落的潜力是明显不同的，并且与临床数据联系起来之后，可能为以后益生菌株的选择和方 法的发展提供一个有益的基础。17，18 近来，粘附检测也被应用于人类回肠造口糖蛋白（用于小肠粘液的模型），并再次表现出不同的益生菌性特征。26

使用结肠活组织检查的体内粘附性研究
排泄物样品被用于益生菌的大多数菌落研究中。27，28 但是，这些反映的仅仅是排泄物质的细菌学表现，并没有给出关于这种表现的胃肠道不同部分或者内脏粘膜层的精确描绘。从结肠镜检查的病人上获取活组织检查物质就具有这样的优点：不仅可以从直肠S形区域，而且可以从大肠（升结肠、横结肠和降结肠）的其他部位获得组织样品。结果，通过使用活组织检查物质检测出一 种商业益生菌株【乳酸杆菌GG（Lactobacillus GG）】优先粘连于大结肠的下降部。在停止益生菌制剂的服用之后，甚至在菌株已经不能在排泄样品中检测出之后，这种益生菌株仍表现出在内脏上皮组织中存活的能力。19 Johansson和他的同事也证明了从服用发酵燕麦汤的志愿者体内获得的不同的乳酸杆菌（Lactobacillus）菌种对直肠粘膜活组织检查样品有 粘附作用。29

免疫学评估
与内脏相关的淋巴组织可能与粘附的益生菌制剂有联系，因此，粘附是引起免 疫效力的一种方法。北欧研究网络研究了益生菌株与用细胞因子产品【人类α-肿瘤坏死因子（human TNF-α），白细胞介素-6（interleukin-6），白细胞介素-10（interleukin-10），肿瘤生长因子-β（TGF-β）和 α-干扰素（interferon-α）】进行的奶制品培育【保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillus bulgaricus），嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）】之间的相互影响。研究人员也检测了已经通过体外TNO胃肠道模型的益生菌株的诱导细胞因子产品【α-肿瘤坏死因子（TNF- α），白细胞介素-6（interleukin-6）】的能力，主要的目的是研究益生菌株在体内是否通过细胞因子刺激免疫系统。白细胞介素-6（IL- 6）产品在用活细菌进行的试验中表现出相当大的变化，测试菌株没有被观察到能够诱导白细胞介素-10（IL-10）。31 研究人员努力开发一种通过Northern杂交探测mRNA的新方法去检测早期的细胞因子应答。这种方法被证实是比ELISA敏感性更高的方法，并且益生 菌株确实生产出白细胞介素-10（IL-10）和白细胞介素-1b（IL-1b）。进一步的研究集中在对通过益生菌的细胞因子诱导通路的分析，对血清蛋白 效力的预测，以及益生菌和人类细胞表面分子之间的相互作用之上。32

胃肠道模型
北欧研究网络对 TNO胃肠道模型的试验集中于益生菌在胃和回肠的运送之后的生存力研究上。SHIME-反应物（SHIME-reactor）被选作阐明小肠和大肠群体动 力学的对象。研究人员确定了pH、氧化还原状态、NH4、SCFA（short-chain fatty acid，短链脂肪酸）、气体组成、酶活性和主要细胞群等参数。如同已经在粘附部分中讨论的一样，来自TNO模型系统不同部分的样品会有不同，一些无法生 存的细菌从TNO模型中复原后也表现出一定的免疫学活性。益生菌治疗表现出可以暂时性地增加SHIME生态系统中不同部分的乳酸菌数量，肠杆菌科细菌在治 疗过程中显著减少。这样的结果表明，为了评价SHIME系统在评估脂肪酸和酶轮廓变化中的重复性，进一步的研究是必须的（表12.5）。33

抗诱变特性
有报道说乳酸菌或培育的奶制品在体外检测中可以减少已知化学诱变剂的诱变性。34 在体内试验中，益生菌株偶而会与排泄物中与诱变或致癌物活化有关的酶活力相关。35 这样的结果在某种程度上与试验中研究的口服益生菌株后实际的排泄物诱变性的效果相矛盾。Lidbeck和他的同事检测到排泄物和尿的诱变性减小，这是由嗜 酸性乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）NCFB 1748所引起的。36 而在使用其他益生菌的相似的检测中并没有得到这样的结果。

12．2．2 Probdemo菌株
Probdemo 工程的首要工作之一是建立益生菌株的选择标准，之后应用这些特殊的标准去选择功能菌株。初步的选择标准包括模拟胃肠道上部（在小肠中遇到胆汁前，这里是益 生菌最先暴露于酸的和富含蛋白酶的环境）条件的体内模型的稳定性。其他应用的选择标准还包括粘附在肠粘膜上的能力，抑制肠内病原菌的能力以及对消费者的安 全性。5，11，12 在这些选择标准下，以下的益生菌株将被选择：
鼠李糖乳杆菌GG（L. rhamnosus GG）, 约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii） LJ-1，唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）UCC118，卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）M247，类干酪乳杆菌（L. paracasei）F19, 和乳制品双歧杆菌（B. lactis）Bb-12。长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）UCC 35624 由于其对于胃肠炎的可能存在的有利影响，后来也被加入到研究行列中。

在表现型和基因型 水平上对这些菌株的描述通过这项工程继续着，这导致了人体肠道内新的菌落机制的发现，如共聚集蛋白的表达。38，39 在安全性的研究中，已经证明编码的万古霉素（vancomycin）在鼠李糖乳杆菌GG（L. rhamnosus GG）中的抗性基因与肠道球菌（Enterococcus）的可转移基因是截然不同的，这表明它们在这个菌株中并未引起安全性的关注。40 目前所知，菌株的益生菌特性更可能是染色体编码的，而非潜在的不稳定的质粒所编码。进一步针对工程菌株的益生菌机制的研究（包括决定它们是如何以及在何处 粘附于肠粘膜上、抑制病原体并诱导宿主体内的免疫调节的分子研究）已经开展了，并着眼于如何选择益生菌和益生菌如何能够有益于人体健康。

12．3 临床人体试验中的探索性试验
益生菌株应该是安全的，并且经过预先的临床试验证明是可以进行与人相关的商业使用的。虽然这是一个重要的方面，但是仍然没有一个严格的针对安全标准的指导方针存在。益生菌食品的临床和安全标准的例子列于表12.6和表12.7中。16，41

益生菌临床试验的指导方针（Probdemo方法）来源于使用志愿者（健康的或者未知带病的）的试验设计。在试验设计中，志愿者应该从针对试验的特殊人群中随机选择。在选择原始的健康志愿者时，研究人员应用了许多排除标准。这些排除标准包括：
·在过去的一个月中的抗生素治疗
·严重的慢性肠道疾病
·慢性的炎症
·慢性的病毒性疾病
·目前的药物疗法